Sonderabdruck aus Hoppe-Seyler's Ztschr. f. phpsiolog. Chem. -244. Bd. (1936). nber die Bedeutung der Fumarslure fiir die tierische Gewebsatmung. III. Mitteilungl). Van E. Aunau, I. Bsnga, A. Blazs6, V. Bruckner, K. Laki, F. B. Straub und A. Szent-Gygrgyi. Mit 5 + 2 + 2 + 1 = 10 Figuren im Text. (Aus dem Institut fiir medizinische Chemie, Universit,2t Szeged.) (Der Schriftleitmg zugegangen am 11. August 1936.) Einleitung, iibersicht, Methoden. \-on A. Szent-GySrgyi. BRS. = Brenztraubensiiure. FS. = Fumarsiiure. OES. = Oxalessigs%ure. AS. = Bpfelsiiure. FAS. = Fumar- plus Apfelsaure"). In den beiden ersten Mitteilungen dieser Reihe3s ") wurden Beobachtungen mitgeteilt, die zeigten, daB die FS. an der Gewebs- atmung als Katalysator beteiligt ist. Ihre Funktion ist die eines intermediiiren Wasserstoffacceptors, der zwischen das System der Nahrstoffdehydrierung und das System der Sauerstoflaktivierung eingeschaltet ist. Zu dieser Funktion wird die FS. durch eine 1) Diese Arbeit wurde durch die Unterstiitzung der Josiah-Macy-Jr.- Stiftung, N e w York, ermoglicht. . . 2) Die FS. oder AS wird im Gewebe durch die Fumarase stets in kiirzester Zeit zum Gleichgewichtsgemisch beider Substanzen umgesetzt,,.so da8 man stets nur letzteres vorfindet. Die Gesamtmenge van FS. plus AS. (FAS) kann aus dem Resultat der FS.-Bestimmung durch Multiplikation mit 4, aus der AS. durch Multiplikation mit 4/3 berechnet werden. 3~ B. GBzsy u. A. Szent-Gyorgyi, Diese Z. 224, 1 (1934). 4, Annau, Banga, Goesy, Huszak, Laki, Straub u. Szent- Gyorgyi, Ebenda, 236, 1 (1935). Hoppe-Segler's Zeitschrift f. physiol. Chemie. CCXLIV. 8 106 A. Szent-GySrgyi, entsprechende Dehydrase aktiviert. Die aktivierte FS. wird durch das System der Sauerstoffaktivierung (0,, Atmungsferment, Cytochrom) zu OES. oxydiert. Die OES. dient dann als Wasserstoffacceptor der N&hrstoffdehyd&rung. Durch die Aufnahme von 2 H-Atomen wird die OES. wieder zn FS. reduziert. Die Funktion der FS. ist also die, den Wasserstoff der Nahrstoffe dem Sauerstoffakti- vierungssystem zur Oxydation zuzufiihren. Die Versuche wurden z. T. durch Boyland und Boyland') sowie G. D. Greville2) bestatigt. Es ist der Zweck vorliegender Arbeit diese Theorie der FS.-Katalyse weiter zu vertiefen. Es war der Mange1 unserer vorgehenden Mitteilung, daB sie sich zum Teil auf qualitative Methoden des OES. -Nachweises sttitzte. Unsere zunehmende Erfahrung lehrte uns, daB in diesem Gebiete des intermed&ren Stoffwechsels qualitative Methoden irre- fiihrend seien. Selbst quantitative Methoden erlauben die Beant- wortung gewisser Fragen nur dann, wenn sie es gestatten, die chemischen Vednderungen in kleinen Gewebsmengen binnen kurzer Zeitabschnitte (2-10 Minuten) bilanzm&iBig zu rer- folgen. Das Ausarbeiten derartiger spezifischer Mikromethoden war urn so mehr nijtig, da sich zeigte, daB die BRS. nicht nur im fermentativen, sondern such im oxydativen Kohlenhydrat-Abbau eine zentrale Rolle spielt. Dank der nahen chemischen Verwandt- schaft der BRS. und der OES. werden alle bekannten Reaktionen der BRS. such durch die OES. gegeben, ist doch die OES. nichts als eine Carboxy-BRS., die mit grol3er Leichtigkeit, such spontan, in BRS. iibergeht. Aus diesem Grunde benijtigten wir zungchst Mikromethoden, die es gestatteten, diese beiden Substanzen neben- einander in spezifischer Weise zu bestimmen. In unserer friiheren Arbeit beniiteten wir zum OES.-Nachweis die Simon-Piauxsche ProbeT, die zum halbquantitativen Nachweis der BRS. schon vielseitig verwendet wurde. Ebenso wie die BRS. gibt such die OES. in Gegenwart von Ammonsulfat und NFI,OH mit Nitroprussidnatron eine tiefblaue Farbe. In reinen Lkungen reagieren BRS. und OES. verschicden und lassen sich such mit dieser Probe unterscheiden. Wghrend indessen die OES. bereits in 2 Minuten eine maximale Farbe gibt, beginnt die Farbe in Gegenwart von BRS. erst nach lingerer Zeit (5 Minuten) zu erscheinen, urn nach 15-20 Minuten maximal LU werden. Wird die OES.-LBsung durch Kochen oder durch Anilin zn BRS. decarboxyliert, so verschwindet die I) Biochemic. J. 30, 224 (1936). ") Biochemic. J. 30, 877 (1936). 9 Bull. Sot. Chim. biol. 6, 477 (1924). iiber die Bedeutung der Fumarsiiure fur die tierische Gewebsatmung. 107 rasche OES.-Reaktion, urn der entsprechenden langsamen Reaktion der BRS. Platz zu machen. Trotzdem aber 15iBt sich die Reaktion nicht zum gleichzeitigen Nach- weis beider Substanzen gebrauchen, weil anwesende BRS. die Rcaktion der OES. (Farbung nach 2 Minuten) sehr verstgrkt, obmohl sie selber in so kurzer Zeit noch keine Reaktion geben wiirde. Ebenso wird such die Reaktion der BRS. durch Spuren von OES., die selber noch keine stirkere Farbe geben, sehr vertieft. Bei Mischungen von OES. und BRS. ver- schwindet also jede Proportionalitiit zwischen Farbe und ?rlenge der zu bestimmenden Substanzen. Dementsprechend fanden wir such, da6 das, was wir in unserer II. Mitteilung als OES. angesprochen baben, oft nur die durch Spuren von OES. verstiirkte Reaktion der BRS. war. Durch diese Feststellung wurde such die Existenz der in unserer II. Mitteilung postnlierten ,,Zwischensubstanz" als Vermittler der Oxydation hinfsllig. Diese Substanz scheint nicht mit der Oxydation, sondern mit der fermentativen BRS.-Bildung verbunden zu sein. Unsere mnhevolle Arbeit fiihrte nun zu Methoden, die die genaue quantitative Bestimmung der OES. und BRS. nebenein- ander gestatten. Die BRS. konnte neben OES. durch Kondensation mit Salicyl-, aldehyd bestimmt werden. BRS. kondensiert mit Salicylaldehyd bei stark alkalischer Reaktion zur tief gefarbten o-Oxybenzal- brenztraubensaure (Perkinsche Synthese). Eine analoge Reaktion wurde bereits durch Csonkal) zur Bestimmung des Acetons heran- gezogen. Unsere Methode der BRS.-Bestimmung lehnt sich an dietie Methode Csonkas. Wie F. B. Straub fand, wird diese Reaktion durch OES. aus theoretisch nicht feststehenden Griinden (weitgehende Enolisierung?) nicht gegeben. Wie Straub findet, ist bei der verwendeten stark alkalischen Reaktion die OES. stabil, so da6 eine spontane De- carboxylierung die BRS.-Bestimmung nicht stiirt. Die OES. kann, wie Straub fand, neben BRS. als 4-Nitroso- pyrazolon-3-carbonsaure bestimmt werden. Mit Hydrazin bildet die OES. ein Hydrazon, das sogleich einen Ringschluh mit der ,6-Carboxylgruppe eingeht. Mit salpetriger Saure behandelt, gibt diesea Pyrazolon am 4 C-Atom eine Nitrosoverbindung, die bei stark alkalischer Reaktion tautomerisierend ein Kalisalz bildet, das eine kolorimetrisch verwertbare intensive gelbe Farbe zeigt. Der Gang der Reaktion, der in einem nachstehenden Abschnitt durch V. Bruckner bewiesen wird, ist also der folgende: `) J. of Biol. Chem. 27, 209 (1916). s* COOH A. Szent-GyGrgyi, Lo AH, &N---N& f (HW AOOH I h=N-NH2 b---N AH, --f JOOH e II III COOH COOK O=N-tiH4 `fiH KO-N=6 hH xl %- IV V Diese Reaktion wird nur durch /7- oder y-Ketone gegeben, die den Ringschlufi einzugehen vermijgen. BRS., Acetaldehyd oder Aoeton geben die Reaktion nicht. Unter den physiologis~h in Betracht kommenden Substanzen ist es nur die Acetessigs~ure, die die Reaktion zu geben vermag. Der Extink~on~oeffizient des ents~ndenen Produktes ist aber lOOma geringer, als der E. der OES., so da8 die Acetessigsiiure die OES-Bestimmung nioht zu stiiren vermag (E. der OES. als Nitrosopyrazoloncarbons&ure = 2166, E. der AcetessigsSiure als Methylnitrosopyrazolon = 21). Der weitere groge Vorteil dieser Bestimmungsmethode der OES. ist der, da6 die Blankversuche ganz farblos sind. Weiterhin beschiiftigt sich Straub in der nachstehenden Arbeit mit der Best~mung der .&S. und der CO,. Messung der CO, gestattet die deearbox~lative Bestimmung der OES. und des RQ. der Atmungsversuche. Methoden zur Bestimmung der FS. und der Bernsteinslure wurden bereits in unserer II. Mitteilung (S. 42 und 54) angegeben. Mit Hilfe dieser Methoden unterzogen wir nochmals die ein- zelnen Phasen der FS.-Katalyse - Oxgdation der B'S, und Re- duktion der OES. - einer eingehenden Untersuchung. Naohdem der bisherige Nachweis der oxydativen Bildung der OES. aus FS. sich auf die unzulangliche Simon-Piauxsche Probe griindete, versuchte zunachst I. Banga neue Beweise der FS.-Oxydation zu erbringen. Wie bereits in unserer frtiheren Mitteilung gezeigt, ist Ton beiden Vorg&ngen, Oxydation der FS. und Reduktion der OES., letzterer der weit intensivere Vorgang, so da6 selbst bei intensiver OES.-Bildung nicht erwartet werden kann, mehr als Spuren dieser fiber die Bedeutung der FumarsLure fiir die tier&he Gewebsatmung. 109 Substanz vorzufinden. DiesesVerhaltnis der Oxydation zur Reduktion kann durch Zugabe von Arsenit zugunsten der ersteren ver- schoben werden. Durch Zugabe von Arsenit werden deutlich me& bare Mengen von OES. nachmeisbar, die aber immer noch zu gering sind, urn als Stiitze unserer Theorie zu dienen. Die Menge der nachweisbaren OES. konnte durch Banga durch Heranziehen eines Abfangmittels noch weiter erhijht werden. Zu diesem Zwecke wurde Hydrazin verwendet. Obwohl Hydrazin bei weitem kein ideales Abfangmittel darstellt, konnte doch durch seine Hilfe unter gtinstigen Bedingungen 1/,-1/z jener OES.-Menge abgefangen werden, die sich bilden mu&e, falls die gesamte Atmung durch Fumarat vermittelt wird. Hierdurch ist nicht nur die oxy- dative Bildung der OES. aus FS. bewiesen, gleichzeitig zeigen diese Versuche, dafi die Dimension dieses Vorganges den lurch unsere Theorie gestellten Forderungen entspricht. Ebenso entspricht der Theorie, wie Banga findet, die Di- mension der Reduktion der OES. durch das Gewebe. Der Muskel vermag in 5 Minuten 2-4 mg OES. zum Schwunde zu bringen. Dies ist 2--4mal mehr als notig, urn annehmen zu konnen, da6 die gesamte Sauerstoffaufnahme iiber FS. verlauft. Gleichzeitig wird gezeigt, da8 binnen der durch die Methode gesetzten Grenzen die verschwundene OES. als F&3. vorgefunden werden kann, ein Beweis dafiir, dal3 der Schwund der OES. tatsachlich durch ihre Reduktion bedingt war und da6 im untersuchten Gewebe der Schwund der OES. als ein Ma8 ihrer Reduktion angesehen werden kann. Anlehnend an diese Resultate wurde von Banga ein weiterer wichtiger Versuch ausgefuhrt, der gestattet, unsere Theorie von einem neuen Blickpunkte aus zu kontrollieren. Unserer Theorie entsprechend ist es die Funktion des Systems Cytochrom, Atmungs- ferment und 0,, die Fumarsaure zu OES. zu oxydieren. Setzt man also OES. zu, so muf3 man hierdurch, falls die Theorie richtig, das genannte System der Sauerstoffaktivierung bei der Atmung ersetzen kiinnen. Die zugesetzte OES. muB mit dem Sauerstoff urn den Wasserstoff der Nahrstoffe in Konkurrenz treten. Bei Zugabe von OES. mu8 also die Sauerstoffaufnahme des Gewebes aufhoren. Kur wenn OES. den physiologischen Wasserstoffacceptor darstellt, darf erwartet werden, da8 sie mit dem natiirlichen Acceptor 0, erfolgreich konkurrieren kann. A priori hatte sich dies nicht erwarten lassen, da doch OES. in vitro keine Elektro- aktivitat besitzt und kein Oxydationsmittel darstellt. 110 A. Szent-GyBrgyi, Die in dieser Richtung ausgefiihrten Versuche zeigten, da@ auf Zugabe der OES. die ganze Sauerstoffaufnahme zum Stillstande kommt, und sogleich mit ihrer gewohnten Aktivitit wieder einsetzt, sobald die zugesetzte OES. reduziert wurde. Dies zeigt also, da6 die OES. dem ganzen System der Sauerstoffaktivierung Bquivalent ist. Zugleich erbringt dieser Versuch den wichtigen Beweis, daB die zugesetzte OES. durch denselben Wasserstoff reduziert wird, der bei der Atmung letzten Endes durch den Sauerstoff verbrannt wird. Es ist also kein kiinstlicher, unphysiologischer ProzeB, der zur Reduktion der OES. fiihrt. Zugleich zeigt der Versuch, daB, so wie dies such bei anderen Dehydrasen der Fall, die Oxydation der FS. durch ihr Oxydationsprodukt, die OES. gehemmt wird. Diese Feststellung ist such aus methodischen Griinden wichtig, da sie es unniitig macht, die Reduktion der OES. unter Sauerstoff- abschluB zu messen. Dementsprechend wurde such gefunden, da6 aerob und anaerob ausgefiihrte kurze Reduktionsversuche mit OES. das gleiche Resultat ergeben. Der aerobe Versuch, dessen Charakter physiologischer ist, scheint sogar noch gtinstiger zu sein. Sodann beschiiftigt sich Banga mit dem RQ. des Muskel- gewebes. Sie zeigt, daB der RQ., der beim zerkleinerten, in Phos- phat suspendierten Muskel urn 0,85 liegt, durch Zugabe von FS. auf die Einheit oder etwas iiber 1 steigt. Dies ist ein nicht un- wichtiger Beweis dafiir, daB die FS. die Oxydation der Kohlen- hydrate vermittelt. Zum Schlusse berichtet Banga iiber einige vergleichende Versuche mit verschiedenen Geweben. Sie findet, daJ3 such Ratten- muskel die OES. energisch reduziert. Etwas schwacher, aber noch stets wohl ausgesprochen, ist der Schwund der OES. im Leber- gewebe. Sehr iiberraschend sind die mit den drei verschiedenen biisartigen Geschwiilsten ausgefiihrten Versuche. Diese Gewebe greifen die OES. iiberhaupt nicht, oder nur spurenweise an, ob- wohl sie im Respirometer deutlich Sauerstoff verbrauchen. Hier scheint also in bezug auf die OES.-Reduktion zwischen normalem und bosartigem Geschwulstgewebe ein wesentlicher Unterschied zu bestehen. Besonders merkwiirdig erscheint dieser Unterschied im Lichte der nachfolgenden Untersuchung A. Blazsos, der findet, daB sich das embryonale Rattengewebe in bezug auf OES. ahnlich verhalt, wie das Geschwulstgewebe. Dasselbe ist such noch bei der Geburt der Fall. Der Umschwung zum normalen Verhalten, d. h. zur Fumarkatalyse, erfolgt in den beiden ersten Wochen des ex- nber die Bedeutung der Fumarslure fiir die tier&he Gewebsatmung. 111 trauterinen Lebens. Die Bernsteinsaure wird durch embryonale Gewebe stark oxydiert, so da8 keine engen Beziehungen zwischen der Bernsteinsaureoxydase und dem Fumaratsystem bestehen kiinnen. DasVerhalten des embryonalen Gewebes sowie der Geschwulste zeigt, daki die FS. sicherlich nicht den einzigen Weg der Atmung darstellt. Banga und Blazsos Arbeiten enthalten noch einige weitere Beobachtungen iiber den Werdegang des Hexosediphosphats in verschiedenen Geweben und enthalten Hinweise darauf, dai3 die Hexose bzw. die aus dieser entstehende Triose durch dasselbe Ferment zur Oxydation (Reduktion der OES.) und Fermentation, (Reduktion der BRS.) aktiviert wird. In einem weiteren Abschnitte beschaftigt sich F. B. Straub mit der Decarboxylierung der OES. im Gewebe. Dies geschieht mit Riicksicht auf clie zahlreichen Theorien des intermediaren Stoffwechsels, die sich auf die noch nie bewiesene rasche kata- lytische Decarboxylierung der OES. griinden. Ware eine solche aktive Decarboxylierung bzw. eine entsprechend intensive ,&Carb- oxylase im Gewebe tatsachlich vorhanden, so kiinnte die OES. unmiiglich die von uns angenommene katalytische Funktion be- sitzen, sondern wiirde zu BRS. decarboxyliert werden. Unsere Ver- suche gaben keinen Anhaltspunkt fiir die Existenz einer solchen aktiven Decarboxylase, zeigten vielmehr, daB, falls ein solches Enzym in dem von uns untersuchten Gewebe iiberhaupt vorhanden ist, seine Aktivitat unter unseren Versuchsbedingungen, verglichen mit der Aktivitat anderer Vorgange der Hauptatmung, nur sehr gering sein und das Resultat unserer kurzen Bilanzversuche nicht wesentlich beeinflussen kann. In dem nachfolgenden Abschnitte wird von K. Laki die so gundlegende Frage der Donatoren der Atmung aufgeworfen. Die Frage war die nach der chemischen Xatur der Substanz, die in unseren Atmungsversuchen dehydriert wird und durch ihren ab- gespaltenen Wasserstoff die OES. reduzierte und bei der Atmung letzten Endes den Sauerstoff verbraucht. Unsere langjahrige Er- fahrung auf diesem Gebiete gab uns keinen Anhaltspunkt dafiir, dal3 Milchsaure hierbei eine wesentliche Rolle spielt'). Die Atmung `) MSglicherweise spielt die Milchsiiure bei der Atmuug des Frosch- muskels eine gr6Bere Rolle. Die me&ten Untersuchungen in dieser Richtung beziehen sich auf dieses Material. Kach den gelliufigen Schemen der Atmung wird fermentativ zuniichst MilchsLure gebildet, diese dann durch Eingreifen 112 A. Szent-GyBrgyi, der Muskelsuspension wird durch Lactatzusatz nicht, oder nur unwesentlich befiirdert. Wird die Bildung von Lactat durch Fluorid oder Jodacetat unterdriickt, so wird die Atmung meistens nicht wesentlich vermindert. Verringert sich die Atmung auf Zusatz dieser Substanzen, so kann die verminderte Atmung nicht durch Lactatzusatz wieder erhijht werden. Sorgt man durch Fumarat- zusatz fiir eine ungestijrte Respiration, so findet man sogar oft, da6 der Zusatz von Fluorid oder Jodacetat die Atmung nicht nur nicht hemmt, sondern sogar erh6ht als Zeichen dafiir, dal3 durch Unterdriickung der Milchs%uregLrung das Substrat der Atmung geschiitzt wurde. Die zum gewaschenen oder ungewaschenen Muskelgewebe zugesetzte MilchsLure vermag such nicht die Reduk- tion der OES. zu befiirdern. DaB Milchsgure als Donator bei der Atmung unseres Muskels keine wesentliche Rolle spiel& zeigt such der Umstand, da8 die dehydrierende Aktivierung des Lactats durch 50 mg-O/, BRS. weitgehend unterdriickt wird, wghrenddessen dieselbe Konzentration dieser Substanz die Sauerstoffaufnahme nicht wesentlich hemmt. Die Reduktion der OES. am gewaschenen Muskel konnte durch Hexosediphosphat, Robisonester oder Glycerinaldehyd - besonders in Gegenwart von Co-Ferment - stark beschleunigt werden. Alle anderen Donatoren, Glucose, Glykogen, Milchsgure, Dioxyaceton, a-Glycerophosphat, &hylalkohol und Zitronensgure waren inaktiv. Laki findet nun, da8 bei der Reduktion der zugesetzten OES. stets nicht unwesentliche Mengen von BRS. entstehen. Diese BRS. konnte unmijglich durch Decarboxylierung der OES. gebildet werden. Die Menge der BRS. stieg in den ersten Minuten der Bebriitung, urn dann spSiter gleich zu bleiben oder abzufallen. Fiir diesen Abfall mu&e ein Schwund der BRS. verantwortlich gemacht werden. Urn also in die quantitativen Verhgltnisse eine bessere Einsicht zu gewinnen, mu&e die Umsetzung der BRS. hintangehalten werden. In Muskelextrakten sind die Resynthesen, die z. T. an die ,,Struktur" gebunden sind, geringer als im Muskel. Dem- entsprechend findet Laki, daB im Extrakt mehr BRS. auf OES. der Oxydation wieder zum Schwunde gebracht. Diese Sequenz der Vorgiinge entspricht der Lebensweise des Frosches, der oft lange Zeit ohne Sauerstoff leben kann, wenn ihm spBter nur die Gelegenheit geboten wird, sich an der Luft zu regenerieren. Dasselbe scheint aber fiir den Warmbliiter nicht zu- zutreffen, der vielmehr unmittelbar vom Sauerstoff, d. h. von oxydativen Prozessen abhiingig ist und keine 1Lngere Zeit auf Rechnung fermentativer Prozesse leben kann. uber die Bedeutung der FumarsSiure fiir die tierische Gewebsatmung. 113 Zusatz erhalten wird, als im zerkleinerten Muskel. Bei kurzer Versuchsdauer sind sogar die gebildeten Mengen der BRS. der gleichzeitig reduzierten OES. squivalent. Der Schwund der BBS. konnte noch weiter durch Zusatz von Arsenit unterdriickt werden [H. A. Krebs')]. Bei Arsenit- zusatz mird zwar such die Reduktion der OES. vermindert, aber die l?bereinstimmung zwischen BRS.-Bildung und OES.-Schwund kann unter Verwendung dieser Substanz such auf lgngere Perioden ausgedehnt werden. Es l&ge an der Hand, die gefundene Bildung Bquivalenter BRS. der Decarboxylierung der OES. zuzuschreiben. Gleichzeitig konnte aber such die Bildung Bquivalenter Menge FliS. nach- gewiesen werden, ein Beweis, daB die OES. nicht durch De- carboxylierung verschwunden ist, sondern durch das Gewebe redu- ziert wurde. Die BRS. konnte also nicht aus der zugesetzten OES. entstanden sein, sondern mu&e sich aus einer dritten Sub- stanz mit drei C-Atomen durch Oxydation mit je zwei Lqui- valenten pro Molekiil bilden. Diese dritte Substanz ist der Wasserstoffdonator der OES.- Reduktion und somit such das Substrat der durch FS. kataly- sierten Atmung unseres Gewebes. Aus dem Gesagten geht hervor, daM sie nur eine Triose sein konnte. Diese Versuche geben such ein Beispiel daftir, dal3 eine klare Antwort auf derartige Fragen des intermediken Stoff- wechsels nur durch ganz kurze (3-5 Minuten) bilanzm8ig aus- gefiihrte Versuche erhalten werden kann. Es fragte sich endlich, ob die FS.-Katalyse sich nur auf den Muskel beschr%nkt, oder aber such in anderen Geweben nach- weisbar ist. Banga zeigte bereits, da8 such die Leber OES. zum Schwunde zu bringen vermag. In unpublizierten Versuchen zeigte sie such, dal3 mit Hilfe des Hydrazin-Abfangverfahrens die Bildung von OES. aus FS., ebenso wie im Muskel, in der Leber nachzuweisen ist. Dies wies bereits darauf hin, daB die FS. such in den Atmungsvorggngen der Leber eine bedeutende Rolle spielt. Immerhin aber schien es wiinschenswert, die Funk- tion der FS. in diesem Organ mit Hilfe eines bekannten H-Dona- tors zu untersuchen. Aus diesem Grunde unterzog Annau in der folgenden Mitteilung die Oxydation der BRS. im iiberlebenden Lebergewebe einer Untersuchung. `) Diese %. 217, 191 (1933). 114 A. Szent-ByGrgyi, Anaau zeigt, daB die Oxydation der BBS. in der Leber tats~chlich durch FS. vermittelt wird. In dieser Arbeit werden sehr merkw~rdige Befunde erhoben, die vielleicht auf den Ililechanis- mus der Acetonogenese ein Lioht werfen. Wie bereits Em bden zeigte und wie Annau bereits friiher best&tigen konntel), vermag das Lebergewebe BRS. in Aceton uinzusetzen. In vorliegender Arbeit wird gezeigt, dal3, falls durch Zugabe von FS. fiir die un- gestiirte Funktion des Fumaratsystems gesorgt ist, pro Mol. BRS. je ein Atom Sauerstoff aufgenommen wird. In diesem Falle kann bei gleichzeitiger Decarboxylierung die BRS. wieder in ein Kohlen- hydratisomeres iibergehen. Kann aber das Fumaratsystem wegen Nangel an FS. seine Funktion nicht ungestijrt ausiiben, so wird weniger als ein 0 pro Mol. BRS. a~fgenommen und es entsteht Aceton. Zuletzt wird durch Laki, in Erg&nzung unserer II. Mittlg., der noch ausstehende Beweis erbracht, da8 das prim&e Produkt der Oxydation der Bernsteins%ure an der Succinodehydrase die FS. ist. Am selben Ferment wird hydrierend such nur FS., nicht hingegen AS. aktiviert. Die L e h m a n n schen Angaben fiber fumarasefreie Succinodehydrase werden bestgtigt 2). Zum Schlusse sei es mir gestattet, einige Worte iiber das Verhbltnis der Oxydation und C&rung hinzuzuftigen. Unsere Ver- suche zeigen, daf3 der H-Donator der OES.-Reduktion und somit der durch Fumarase katalysierten Atmung das Kohlenhydrat ist, Dies geht aus der Messung des RQ. durch Banga hervor, Die Versuche Lakis zeigen, d& unmi~elbar eine Triose (oder Triose- phosphors%ure) oxydiert wird. *) Diese Z. 224, 141 (1934). 3 Es ist nicht gegliickt, ein fumarasefreies Prgparat herzustellen, das OES. mit geniigender Intensitiit reduzierte, und hiermit die Frage des prim&en Produktes der OES.-Reduktion und somit such die Frage der biologischen Funktion der Fumarase definitiv zu l&en. Nachdem aber OES. durch chemische Mittel stets zu AS. und nicht zu FS. redutiert wird, so ist dies alIer Wahrscheinlichkeit nach such im Muskel der Fall. In unserer II. Mittlg. eeigte Laki bereits, dsfa im Muskel nur die FS., nicht hingegen Ais. zu OES. oxydiert wird. Dies l&t die Funktion der Fumarase doch mit groler Wahrsche~liehkeit angeben, Die Funktion dieses Fermentes ist es anscheinend, die durch Reduktion der OES. ent- standene .&X in FS. zu iiberf&ren und somit zur erneuten Oxydation zu bef&higen. Die Fumarkatalyse stellt also keinen einfachen Wecbsd van FS.-OES., sondern einen Zyklus dar: Fumarat - Oxalacetat K / ober die Bedeutung der Fumarsiiure fiir die tierische Gewebsatmung. 115 Meyerhofs Arbeit iiber den Hauptweg der Milchs%uregbung des Muskels zeigt, da5 die G&rung eigentlich eine Oxydation der Triose durch BRS. darstellt. Die Atmung ist nach unseren Unter- suchungen eine Oxydation der Triose durch OES. Hieraus geht hervor, daB Atmung und G&rung identische Vorggnge sind mit dem Unterschied, daW bei der Ggrung als H-Acceptor BRS., bei der Atmung als H-Acceptor eine Carboxy-BRS., d. h. OES. dient. Die I\`atur scheint bei der Atmung das System der G&rung bei- behalten zu haben, sie hat nur das als Acceptor dienende BRS.- Molekiil mit einer Carboxylgruppe beschwert, hierdurch der Re- synthese zu Kohlenhydrat entzogen und somit zu einer katalytischen Funktion befghigt I). Hierdurch wird such ein neuer quantitativer Zusammenhang der Atmung und Gzrung (Pasteursche Reaktion) deutlich. BRS. und OES. miissen fiir den aktivierten Wasserstoff in Konkurrenz treten. Bei SauerstoffabschluB wird keine OES. gebildet. Anaerob steht nur BRS. als Acceptor zur Verfiigung und das Kohlen- hydrat kann nur fermentativ abgebaut werden. Aerob hingegen wird OES. gebildet, die nun mit der BRS. in Konkurrenz tritt, so dal3 sich die Vorggnge der Oxydation zu verschieben. Aus dem Blickpunkte dieser Versuche scheint es such, daB das eigentliche System der Oxydation bzw. Sauerstoffaktivierung (Atmungsferment, Cytochrom) nicht direkt oxydativ in den Kohlen- hydratzyklus eingreift, sondern sich in seiner Funktion auf die Oxydation der beiden analogen Reduktionsprodukte, lipfelsgure @her Fumarat) und Milchs%ure beschrgnkt. In dem nachfolgenden experimentellen Teil werden die Be- stimmungsmethoden ausfiihrlich beschrieben. Jedoch werden der Kiirze halber von sonstigen Versuchen nur Beispiele gegeben. Die zitierten Versuche wurden aber so oft ausgefiihrt, bis wir uns van der Realitst ihrer Ergebnisse iiberzeugten. Zuletzt mijchte ich nun darauf hinweisen, da8 vorliegende Brbeit die einfache Messung einer neuen charakteristischen GrijBe des respiratorischen Stogwechsels ermiiglicht. Nachdem die OES. vorwiegend durch Reduktion verschwindet, kann der Schwund dieser `) Durch den Eintritt der zweiten Carboxylgruppe erhalten such die b&den mittleren C-Atome besondere Eigenschaften, die miiglicherweise fiir die katalytische Funktion von Bedeutung sind. Wie ich bereits friiher darauf hingewiesen habe, gibt es in der Natur nur eine Substanzgruppe, in der es in einem minimelen Volumen zwei benachbarte C-Atome gibt, die beide zugleich n- und p'-C- Atome sind: die 4 C-atom&en Dicarbonsiiuren. 116 A. Szent-GyBrgyi, Substanz binnen gewisser Grenzen als MaB ihrer Reduktion be- trachtet werden. Der Schwund IaiBt sich mit den beschriebenen Methoden leicht in genauer Weise verfolgen. Die OES.-Reduk- tion gibt die Menge des in der Zeiteinheit labilisierten und iibertragbar gemachten Wasserstoffes. In der Thunbergschen Methode, bei der relativ geringe Mengen von Farbstoffen reduziert werden, wird mehr die Intensitat des Reduktionsvermagens der Gewebe gemessen. Diese wird aber auoh nicht eindeutig zum Aus- drucke gebracht. Bei der Verwendung der OES. als Indicator hat man weiterhin den Vorteil, mit dem natiirlichen Acceptor der Gewebe zu arbeiten. Es ist mir ein Vergniigen, diese Besprechung mit dem Aus- drucke meines Dankes an Herrn Prof. St. Sz eged y fiir sein Mit- arbeiten und seine wertvollen Ratschlage zu schliefien. Methoden. Die allgemeine Methodik unserer Versuche glich anniihernd der unserer vorhergehenden Mitteilung. Als Material diente, wo nicht anders hervorgehoben, such hier der Brustmuskel der Taube. Die Tiere wurden durch Decapitieren getiitet, der Brustmuskel sogleich ausgeschnitten und das Gewebe in der auf 0" vor- gekiihlten La t a p i e - Miihle gemahlen. (Eigenschaften und Dimensionen des Breies vgl. II. Mttlg. S. 16.) Der Brei wurde sogleich im eisgekiihlten 2,65/15 M SBrensen-Phosphat van pH 7 suspendiert. Auf je 1 g Muskel wurden 3ml Phosphat gebraucht. Diese Suspension wurde dann mit einer graduierten Pipette zum Versuch verteilt. Vor dem Pipettieren wurde die Suspension mit einem elektrischen Riihrer einige Sekunden energisch durch- geriihrt, wodurch die Muskelteilchen sich in der Lijsung gleichmilfiig ver- teilten und ein genaues Pipettieren (& 6O/,, gemittelter Fehler + 3O/,) er- miiglichten. Zum Versuch wurde stets 1,5 ml dieser Suspension verwendet und mit Wasser oder sonstigen Zusiitzen auf 4 ml verdiinnt. Die Endkonzen- tration des Phosphates war also m/15. Die zu einem Versuch gebrauchte Menge des Muskels war 0,4 g. Die also eubereiteten Suspensionen wurden unverziiglich zum Versuch herangeeogen. Die respirometrischen Versuche wurden, abgesehen von besonders hervorgehobenen Ausnahmen, im War b u r g schen Respirometer ausgeftihrt. Die HZihne wurden nach den ersten 10 Minuten geschlossen, die zur Er- reichung des Temperaturgleichgewichtes niitig waren. 2 = 37O C. Zum Zwecke sonstiger Versuche wurde die Suspension in kleine 50 ml-Erlenmeyerkiilbchen eingetragen. Kiilbchen und Respirometer wurden in gleicher Weise im Wasserbade von 37" C versenkt und geschiittelt. Zur Enteiweibung wurde aufje 4 ml der Suspension 0,5 ml lO"/,ige H,SO, und 0,5 ml lOO/,iges Natriumwolframat zugesetzt, die Mischung durch- geschiittelt, zentrifugiert. Die klare L&sung wurde dann zu den weiteren Beetimmungen verwendet.